Alternative Screeningmethode für positive pLKO-Klone

Bezug­neh­mend auf das Klo­nie­rungs­pro­to­koll von Addge­ne für den len­ti­vi­ra­len Vek­tor pLKO.1 möch­te ich hier ger­ne eine alter­na­ti­ve Scree­ning­me­tho­de für posi­ti­ve Klo­ne vor­stel­len.
Das Ori­gi­nal­pro­to­koll sieht vor, einen Dop­pel­ver­dau mit Eco­RI und NcoI vor­zu­neh­men. Im Ergeb­nis erhält man zwei rela­tiv gro­ße Ban­den, eine bei 2kb und eine bei 5kb. Die dar­aus resul­tie­ren­den Län­gen­ver­hält­nis­se machen es schwie­rig, Klo­ne mit intak­tem Insert sicher zu iden­ti­fi­zie­ren. Mit dem alter­na­ti­ven Pro­to­koll erhält man nach einem Ver­dau mit XhoI ein Gel­bild, was mei­ner Mei­nung nach deut­lich leich­ter zu inter­pre­tie­ren ist:

Alternatives Screening-Protokoll

Material

• Plas­mid Mini­prep Kit (Qia­gen #27104)
• XhoI (Fer­men­tas #ER0691)
• Top­Vi­si­on LE Aga­ro­se (Fer­men­tas #R0491)
• Roti­pho­re­se 10x TBE-Buffer (Carl Roth 3061.1)

Procedere

1. (Tag 1) Nach der Tra­fo und 16–18h Kul­tur auf LB-Amp Agar­plat­ten ca. 5–10 Kolo­nien von der Plat­te picken und in 3ml LB-Amp über­nacht kultivieren.
2. (Tag 2) 2ml der ÜN-Kultur für eine Mini-Präp ver­wen­den,
   Ach­tung: für den Elu­ti­ons­schritt ddH₂O oder Tris-HCL Puf­fer neh­men, da EDTA die anschlie­ßen­den enzy­ma­ti­schen Reak­tio­nen stö­ren kann. Die rest­li­che Kul­tur wird vor­über­ge­hend im Kühl­schrank bei +4°C gela­gert oder kann als Gly­ce­rol­stock ein­ge­fro­ren werden.
3. Für die pho­to­me­tri­sche Mes­sung des DNA-Gehalts, mache eine 1:100 Ver­dün­nung mit 5µl mini­prep DNA und 495µl ddH₂O
4. Set­ze einen Master-Mix für den Verdau-Ansatz an (pla­ne für n+2 Ansät­ze).
   Berech­ne für jeden Ansatz:

    

   • 1µg mini­prep DNA
   • 2µl Puf­fer R (Fer­men­tas 10x Puf­fer für XhoI)
   • 0.5µl XhoI
   • auf 20µl ddH₂O
5. Inku­bie­re die Ver­dau­an­sät­ze bei 37°C für 1–2h
6. Tra­ge die Ver­dau­an­sät­ze auf ein 1% Aga­ro­se­gel auf und mache einen Gel­lauf bei 10V/cm für ca. 45 Minuten.

Posi­ti­ve Klo­ne haben eine deut­li­che Ban­de bei 380bp, außer­dem eine schwa­che Ban­de bei 190bp und den „Rest“ bei ~5000bp. Die­se Klo­ne soll­ten zur Sequen­zie­rung ein­ge­schickt wer­den. Bei nicht intak­ten Inserts ergibt sich ein Ban­dens­hift von 50–80bp. Klo­ne mit reli­gier­tem Stuf­fer haben außer­dem eine Ban­de bei ~2000bp.