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Alternative Screeningmethode für positive pLKO-Klone

Mario — Wed, 26 Sep 2007 22:20:36 +0000

Bezugnehmend auf das Klonierungsprotokoll von Addgene für den lentiviralen Vektor pLKO.1 möchte ich hier gerne eine alternative Screeningmethode für positive Klone vorstellen.
Das Originalprotokoll sieht vor, einen Doppelverdau mit EcoRI und NcoI vorzunehmen. Im Ergebnis erhält man zwei relativ große Banden, eine bei 2kb und eine bei 5kb. Die daraus resultierenden Längenverhältnisse machen es schwierig, Klone mit intaktem Insert sicher zu identifizieren. Mit dem alternativen Protokoll erhält man nach einem Verdau mit XhoI ein Gelbild, was meiner Meinung nach deutlich leichter zu interpretieren ist:

Alternatives Screening-Protokoll

Material

Plasmid Miniprep Kit (Qiagen #27104)
XhoI (Fermentas #ER0691)
TopVision LE Agarose (Fermentas #R0491)
Rotiphorese 10x TBE-Buffer (Carl Roth 3061.1)

Procedere

(Tag 1) Nach der Trafo und 16-18h Kultur auf LB-Amp Agarplatten ca. 5-10 Kolonien von der Platte picken und in 3ml LB-Amp übernacht kultivieren.
(Tag 2) 2ml der ÜN-Kultur für eine Mini-Präp verwenden,
Achtung: für den Elutionsschritt ddH₂O oder Tris-HCL Puffer nehmen, da EDTA die anschließenden enzymatischen Reaktionen stören kann. Die restliche Kultur wird vorübergehend im Kühlschrank bei +4°C gelagert oder kann als Glycerolstock eingefroren werden.
Für die photometrische Messung des DNA-Gehalts, mache eine 1:100 Verdünnung mit 5µl miniprep DNA und 495µl ddH₂O
Setze einen Master-Mix für den Verdau-Ansatz an (plane für n+2 Ansätze).
Berechne für jeden Ansatz:
- 1µg miniprep DNA
- 2µl Puffer R (Fermentas 10x Puffer für XhoI)
- 0.5µl XhoI
- auf 20µl ddH₂O
Inkubiere die Verdauansätze bei 37°C für 1-2h
Trage die Verdauansätze auf ein 1% Agarosegel auf und mache einen Gellauf bei 10V/cm für ca. 45 Minuten.

Positive Klone haben eine deutliche Bande bei 380bp, außerdem eine schwache Bande bei 190bp und den “Rest” bei ~5000bp. Diese Klone sollten zur Sequenzierung eingeschickt werden. Bei nicht intakten Inserts ergibt sich ein Bandenshift von 50-80bp. Klone mit religiertem Stuffer haben außerdem eine Bande bei ~2000bp.

Umrechnungstabelle zur Zentrifugengeschwindigkeit

Mario — Tue, 21 Aug 2007 14:13:38 +0000

Wer kann sich noch erinnern, wie man aus der Umdrehungsgeschwindigkeit einer Zentrifuge (rpm) auf das Vielfache der Erdbeschleunigung (g) kommt?! Richtig – die Formel lautet:

F = 1.12 × 10^-5 rpm² × r

Wobei man bei der Angabe des Radius (r) bedenken muss, ob man den minimalen, den mittleren oder den maximalen Radius des Rotors verwendet, da der Abstand der Drehachse des Rotors zum oberen bzw. unteren Rand des Röhrchens meistens unterschiedlich ist.

Um die Umrechnung zu erleichtern, habe ich eine Excel-Vorlage erstellt, die man hier runterladen kann:

Umrechnungstabelle Zentrifugengeschwindigkeit (Excel-Sheet)
Diese Excel-Vorlage dient zur Umrechnung von U/min auf xG, man muss nur den korrekten Rotoren-Radius eingeben.
[ 21.5 KB ] [ 13. Apr 2008 ] [ 10,310x heruntergeladen ]

Weitere Informationen

Beckman Coulter: Centrifuge Rotor Calculations. Online-Formular zur Umrechnung von rpm in g, (nicht nur) für Beckman Zentrifugen.

Update vom 26.09.2007: Dieser Beitrag gehört mittlerweile zu den beliebtesten Seiten meiner Homepage… Bei Google belege ich inzwischen für einige Suchbegriffe damit sogar den ersten Platz. Mich interessiert natürlich, aus welchen Ecken der Welt Ihr so kommt und was Ihr mit der Umrechnungstabelle vorhabt. Ich würde mich daher sehr über den einen oder anderen Kommentar freuen! Danke im Voraus!

Ultrazentrifugation von Viruspartikeln

Mario — Mon, 20 Aug 2007 14:38:50 +0000

Gerade habe ich ein Protokoll zur Ultrazentrifugation von Viruspartikeln und Aufreinigung der Viren mithilfe eines Saccharosekissens hochgeladen. Mit diesem Protokoll ist es möglich, den Virustiter um mindestens eine Logstufe zu erhöhen. Außerdem können mit dem so aufgereinigten Virus auch empfindliche Zellen (z.B. Stammzellen) transduziert werden, welche ansonsten nicht gut mit dem 293T-Medienüberstand zurecht kommen.
Die neu erstellte Seite Forschung»Protokolle hat damit ihren ersten Eintrag erhalten.