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Alternative Screeningmethode für positive pLKO-Klone

Mario — Wed, 26 Sep 2007 22:20:36 +0000

Bezugnehmend auf das Klonierungsprotokoll von Addgene für den lentiviralen Vektor pLKO.1 möchte ich hier gerne eine alternative Screeningmethode für positive Klone vorstellen.
Das Originalprotokoll sieht vor, einen Doppelverdau mit EcoRI und NcoI vorzunehmen. Im Ergebnis erhält man zwei relativ große Banden, eine bei 2kb und eine bei 5kb. Die daraus resultierenden Längenverhältnisse machen es schwierig, Klone mit intaktem Insert sicher zu identifizieren. Mit dem alternativen Protokoll erhält man nach einem Verdau mit XhoI ein Gelbild, was meiner Meinung nach deutlich leichter zu interpretieren ist:

Alternatives Screening-Protokoll

Material

Plasmid Miniprep Kit (Qiagen #27104)
XhoI (Fermentas #ER0691)
TopVision LE Agarose (Fermentas #R0491)
Rotiphorese 10x TBE-Buffer (Carl Roth 3061.1)

Procedere

(Tag 1) Nach der Trafo und 16-18h Kultur auf LB-Amp Agarplatten ca. 5-10 Kolonien von der Platte picken und in 3ml LB-Amp übernacht kultivieren.
(Tag 2) 2ml der ÜN-Kultur für eine Mini-Präp verwenden,
Achtung: für den Elutionsschritt ddH₂O oder Tris-HCL Puffer nehmen, da EDTA die anschließenden enzymatischen Reaktionen stören kann. Die restliche Kultur wird vorübergehend im Kühlschrank bei +4°C gelagert oder kann als Glycerolstock eingefroren werden.
Für die photometrische Messung des DNA-Gehalts, mache eine 1:100 Verdünnung mit 5µl miniprep DNA und 495µl ddH₂O
Setze einen Master-Mix für den Verdau-Ansatz an (plane für n+2 Ansätze).
Berechne für jeden Ansatz:
- 1µg miniprep DNA
- 2µl Puffer R (Fermentas 10x Puffer für XhoI)
- 0.5µl XhoI
- auf 20µl ddH₂O
Inkubiere die Verdauansätze bei 37°C für 1-2h
Trage die Verdauansätze auf ein 1% Agarosegel auf und mache einen Gellauf bei 10V/cm für ca. 45 Minuten.

Positive Klone haben eine deutliche Bande bei 380bp, außerdem eine schwache Bande bei 190bp und den “Rest” bei ~5000bp. Diese Klone sollten zur Sequenzierung eingeschickt werden. Bei nicht intakten Inserts ergibt sich ein Bandenshift von 50-80bp. Klone mit religiertem Stuffer haben außerdem eine Bande bei ~2000bp.

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Umrechnungstabelle zur Zentrifugengeschwindigkeit

Mario — Tue, 21 Aug 2007 14:13:38 +0000

Wer kann sich noch erinnern, wie man aus der Umdrehungsgeschwindigkeit einer Zentrifuge (rpm) auf das Vielfache der Erdbeschleunigung (g) kommt?! Richtig – die Formel lautet:

F = 1.12 × 10^-5 rpm² × r

Wobei man bei der Angabe des Radius (r) bedenken muss, ob man den minimalen, den mittleren oder den maximalen Radius des Rotors verwendet, da der Abstand der Drehachse des Rotors zum oberen bzw. unteren Rand des Röhrchens meistens unterschiedlich ist.

Um die Umrechnung zu erleichtern, habe ich eine Excel-Vorlage erstellt, die man hier runterladen kann:

Umrechnungstabelle Zentrifugengeschwindigkeit (Excel-Sheet)
Diese Excel-Vorlage dient zur Umrechnung von U/min auf xG, man muss nur den korrekten Rotoren-Radius eingeben.
[ 21.5 KB ] [ 13. Apr 2008 ] [ 10,310x heruntergeladen ]

Weitere Informationen

Beckman Coulter: Centrifuge Rotor Calculations. Online-Formular zur Umrechnung von rpm in g, (nicht nur) für Beckman Zentrifugen.

Update vom 26.09.2007: Dieser Beitrag gehört mittlerweile zu den beliebtesten Seiten meiner Homepage… Bei Google belege ich inzwischen für einige Suchbegriffe damit sogar den ersten Platz. Mich interessiert natürlich, aus welchen Ecken der Welt Ihr so kommt und was Ihr mit der Umrechnungstabelle vorhabt. Ich würde mich daher sehr über den einen oder anderen Kommentar freuen! Danke im Voraus!

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Journalistische “Nachwehen” des Schülerprojekttages 2007

Mario — Tue, 21 Aug 2007 13:05:35 +0000

Die Zeitschrift einblick, das Publikationsorgan des Deutschen Krebsforschungszentrums (DKFZ), hat unserer Abteilung in ihrer aktuellen Ausgabe (02/2007) anlässlich der Berichterstattung zum Schülerprojekttag “Stammzellforschung” (siehe meinen Beitrag dazu) einen kleinen Absatz gewidmet:

Um Stammzellen aus dem Blut ging es in der Leukapherese-Einheit in der Medizinischen Universitätsklinik Heidelberg. Dort lernten die Schüler von Professor Peter Dreger, wie Stammzellen bei einer Art Blutwäsche für die Stammzelltransplantation gewonnen werden. Sein Kollege Dr. Mario Schubert zeigte, wie die wertvollen Zellen für Forschungszwecke weiter aufbereitet werden.
Am Ende des Tages gab es zufriedene Gesichter bei Schülern wie Forschern.

Anschließend wird mein Kollege Thomas Luft zitiert, dem möchte ich mich vorbehaltlos anschließen: “Wir sind in jedem Fall wieder dabei, wenn nächstes Jahr erneut ein Schülerprojekttag stattfindet.”

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Naturwissenschaftliche Praktikanten willkommen!

Mario — Thu, 16 Aug 2007 13:44:17 +0000

Für naturwissenschaftliche Studenten (Medizin, Biologie, Pharmakologie etc.) oder naturwissenschaftlich interessierte Abiturienten besteht jederzeit die Möglichkeit, in unserer Arbeitsgruppe ein Praktikum zu absolvieren. Für eine Maximaldauer von zwei Monaten können Sie einen Einblick in die moderne Stammzellforschung erhalten und je nach Fertigkeiten und Interessen in unserem Labor selbst mitarbeiten… einfach eine eMail an mich schreiben (siehe Kontaktinfo)!

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Biologische/r Diplomand/in gesucht!

Mario — Mon, 23 Jul 2007 06:47:03 +0000

In meinem Labor ist ab sofort die Stelle eines/einer biologischen Diplomanden/in zu besetzen. Das Thema der geplanten Arbeit lautet:

Rolle des Wnt-Pathways bei humanen hämatopoetischen Stammzellen

Hintergrund: hämatopoetische Stammzellen (HSC) benötigen zum Erhalt ihrer Stammzellfunktion die Interaktion mit ihrer Stammzellnische. Eine zentrale Rolle in der Regulierung von Selbsterhalt und Differenzierung scheint der Wnt-Pathway einzunehmen.

Tierexperimentell konnten bereits entsprechende Hinweise gesammelt werden. Eigene Vorarbeiten mit humanen Zellen suggerieren jedoch einen möglicherweise abweichenden Regulationsmechanismus beim Menschen. In der vorliegenden Arbeit soll daher erstmals in vitro bei CD34+/(CD38-) humanen hämatopoetischen Progenitorzellen die Rolle des Wnt-Pathways bei Selbsterhalt und Differenzierung untersucht werden. Hierzu stehen einige stimulierende und inhibierende Wnt-Liganden (z.B. Wnt3A, RSPO2, DKK1) und chemische Compounds, sowie geeignete zell- und molekularbiologische Methoden zur Verfügung.

Lesen Sie auf der Seite Forschung mehr zu meinem Labor und den verwendeten Methoden.

Wir erwarten: überdurchschnittliches Engagement, solide Grundkenntnisse, selbständiges Arbeiten.
Wir bieten: gute Einarbeitung und engagierte Betreuung, fachkundige Supervision, regelmäßige Fortbildungsveranstaltungen, kollegiales Umfeld.
Wir freuen uns auf Ihre Bewerbung!
Richten Sie diese bitte in elektronischer Form (eMail) an mich.

Weitere Informationen

Vollständiger Angebotstext bei doktorandenbörse.info

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Schülertag 2007

Mario — Thu, 03 May 2007 09:09:47 +0000

Zum zweiten Mal hatten naturwissenschaftlich interessierte Oberstufenschüler aus Heidelberg die Möglichkeit, einen hautnahen Einblick in die medizinische Forschung zu erhalten. Circa zweihundert Schüler aus den umliegenden Gymnasien nutzten gerne diese Gelegenheit. Nach einleitenden Vorträgen zu verschiedenen Interessaten Themen (Hydra-Modell, Stammzellforschung etc.) wurden die Schüler aufgeteilt, um in kleinen Gruppen von je sechs bis zehn Personen die verschiedenen Forschungseinrichtungen zu besichtigen.

Vor dem Gebäude der medizinischen Klinik wartete das Rollende Genlabor auf die jungen Forscher. Andere Gruppen machten sich auf den Weg ins DKFZ und zu diversen Forschungseinrichtungen im Neuenheimer Feld und Technologiepark (z.B. zu Cytonet).

Auch unser Labor wurde von zwei Schülergruppen besucht. Mit erfreulich geringen Berührungsängste durften die Schüler selbst die ersten Schritte der Stammzellisolierung praktisch üben – neben sterilem Pipettieren mit dem Peleusball und Dichtegradientenzentrifugation standen die Zellfärbung und Auszählung in der Neubauer-Kammer auf dem Programm. Außerdem konnten die Schüler unter dem Mikroskop den Unterschied zwischen einem gesunden und einem an leukämie erkrankten Knochenmark selbst erfahren. Im FACS-Labor erklärte Herr Dr. Eckstein anschließend anschaulich die weiteren Schritte der Stammzellanreicherung mittels magnetobeads (MACS) und floureszenzaktivierter Zellsortierung (FACS).

Insgesamt war es ein schöner Tag, sowohl für unser ganzes Laborteam, als auch hoffentlich für die Schüler, welche den Besuch in unserem Labor in der anschließenden anonymen Evaluation immerhin mit einer glatten Note Eins belohnten!

Neben einem Kamerateam von Campus-TV waren auch der Mannheimer Morgen und die Rheinneckarzeitung bei uns zu Besuch und berichteten ausführlich über das Event (siehe RNZ-Artikel vom 02.05.2007).

Weitere Informationen:

Transkript des Campus-TV Beitrages (16.05.2007)
Pressemeldung der Uni Heidelberg (April 2007)

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Busy Days

Mario — Fri, 13 Feb 2004 09:20:34 +0000

The last days were filled with bustling activity and brought big changes. two weeks ago my new mentor Peter and i went to the clinic for tumor biology in freiburg to learn a new technique called “spheroid-assay”. this assay can be used to analyse the three-dimensional groth of new blood vessels in a cell culture. we spent the whole day peeking into culture plates, medium flasks and microscopes, thorougly writing down everything. the guys there were great (esp. big thank you to holger and oliver)! So, in the next few months Peter and myself will establish the spheroid-assay at our lab at the pancreas research center in heidelberg.
last week i got a phone call from the surgery’s residency director asking me to begin my clinical work next monday (!) initially i was supposed to start my residency in april… just the other day i gave the first “release candidate” of my medical thesis to dr. schwartz-albiez, who is my supervisor at the dkfz. i keep my fingers crossed that he agrees on submitting the work without further editing. yipee! today i got my medical identity card. now i am officially enabled to get all those fine drugs and pills (just for my own requirements) at the pharmacy

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